NITROEXTREM: Bem, quase que já estou de partida!

O tempo aqui demonstrou ser um grande sprinter, não pára e, quando dou por mim, já quase passaram 3 meses. Mas bem, as experiências ficam comigo e as memórias guardo-as para talvez um dia serem escritas. Nas semanas que passaram tenho prosseguido com as minha incubações. Tenho continuado a extrair DNA e RNA e comecei a tentar amplificar o gene que estou a estudar, o gene amoA responsável pela transcrição da enzima ammonia monooxigenase. Esta enzima promove a oxidação da amónia num composto intermediário - a hidroxilamina. Esta reação promove a libertação de eletrões que são transferidos ao longo de uma cadeia, na qual será libertada energia fundamental para o funcionamento celular. Esta reação é bastante importante para a nitrificação uma vez que é o passo limitante deste processo. Este gene é também usado como um marcador funcional das bactérias e arqueias que oxidam a amónia. Então, a boa notícia, é que nas amostras de solo do Miers consegui detectar o gene no DNA em todas as amostras até agora processadas, tanto no domínio Bacteria como no Archaea, mas ainda mais entusiasmante, foi que consegui detectar o gene no cDNA (derivado do RNA) de algumas amostras extraídas, dando a indicação que ele esta a ser expresso. Deste modo, estes resultados deram-me a indicação de que as comunidades nitrificantes não só estão lá presentes (demonstrado pelo DNA), como também estão ativas (demonstrado pela presença do gene no RNA). No que toca ao solo do Beacon os resultados não são tão positivos, uma vez que ainda não consegui detectar o gene em nenhuma amostra; no entanto, continuo a trabalhar nisso.

Um método que estou também aqui a aprender é a nova tecnologia de sequenciamento da Life Tecnhlogies chamada Ion Torrents. Esta tecnologia é capaz de gerar milhares de sequências num relativo curto espaço de tempo (8h no máximo). Este método baseia-se na detecção de protões que são libertados durante a polimerização do DNA. Os protões libertados vão conduzir a alterações no pH num chip, que serão lidas pela máquina. A preparação das amostras envolve um grande cuidado e precisão. Assim, muito brevemente, o que se faz é o seguinte: extrai-se o DNA; amplifica-se o DNA para o gene que queremos sequenciar (no meu caso sequenciei o 16S); nesta amplificação usamos um primer que contém um código que identificará a nossa amostra durante a sequenciação. Assim cada amostra tem um código diferente, o que possibilita juntar diferentes amostras na mesma corrida de sequenciação. Após a amplificação cada amostra é quantificada e limpa. Esta é novamente quantificada (durante o processo de limpeza há sempre perda de DNA) e diluída para uma determinada concentração. 

Emulsion PCR

Enrichment

Sequencing Chip

Ion Torrents Sequencer

Para ver o estado da amostra corremos as amostras no 'bioanalzyser' e o que queremos ter é um limpo pico entre dois padrões. Feito isto começa-se a fazer a final 'genomic library'. Ou seja: primeiro diluímos cada amostra até uma determinada concentração e, de modo a obter-se equimolaridade, o mesmo volume de cada amostra é pipetado no mesmo tubo produzindo um pool de amostra. Este pool vai então ser sujeito a um 'emulsion PCR' ou seja, durante este processo cada fragmento/sequência de DNA vai ligar-se a uma bead presente num microreactor e vai ser amplificada cerca de 30000x. De modo a diferenciarmos as beads que contêm fragmento amplificado daquelas que não têm, faz-se um enrichment step. O produto enriquecido é então introduzido num chip com carácter semi condutor e sequenciado. Como disse inicialmente, cada vez que uma base é incorporada na cadeia de DNA há libertação de um protão alterando o pH de uma camada do chip, sendo essa alteração convertida numa alteração de voltagem lida pela máquina.

Deixo-vos algumas fotos desta técnica! 
Até breve!
Maria Monteiro