PROPOLAR
  • SOBRE
    • MISSÃO
    • HISTORIA
    • ORGANIZACAO E EQUIPA
    • FINANCIAMENTO
    • COLABORACOES
    • O VOO PROPOLAR
    • CONTACTOS
    • FAQ
  • ATIVIDADES
    • PROPOLAR 2021-22
    • PROPOLAR 2020-21
    • Diario de campanha 2020-22
    • NOTÍCIAS PROPOLAR
    • COMUNICADOS DE IMPRENSA
  • ARQUIVO
    • CAMPANHAS E PROJETOS FINALIZADOS
    • CONFERÊNCIAS POLARES
    • CONVOCATÓRIA A PROJETOS
  • MATERIAIS E DOCUMENTAÇÃO
    • DOCUMENTAÇÃO DAS CAMPANHAS >
      • DOCUMENTOS DAS CAMPANHAS
      • Tratado Antártica & Protocolo Madrid
    • INFOTECA POLAR
    • PUBLICAÇÕES >
      • RESULTADOS CIENTIFICOS
      • RELATÓRIOS PROPOLAR
    • RELATÓRIOS INTERNACIONAIS
    • NORMATIVAS POLARES
    • MULTIMÉDIA
    • EXPOSIÇÕES >
      • EXPOSIÇÃO CARTOGRÁFICA
      • EXPOSIÇÃO FOTOGRÁFICA
      • FICHAS EDUCATIVAS
  • SOBRE
    • MISSÃO
    • HISTORIA
    • ORGANIZACAO E EQUIPA
    • FINANCIAMENTO
    • COLABORACOES
    • O VOO PROPOLAR
    • CONTACTOS
    • FAQ
  • ATIVIDADES
    • PROPOLAR 2021-22
    • PROPOLAR 2020-21
    • Diario de campanha 2020-22
    • NOTÍCIAS PROPOLAR
    • COMUNICADOS DE IMPRENSA
  • ARQUIVO
    • CAMPANHAS E PROJETOS FINALIZADOS
    • CONFERÊNCIAS POLARES
    • CONVOCATÓRIA A PROJETOS
  • MATERIAIS E DOCUMENTAÇÃO
    • DOCUMENTAÇÃO DAS CAMPANHAS >
      • DOCUMENTOS DAS CAMPANHAS
      • Tratado Antártica & Protocolo Madrid
    • INFOTECA POLAR
    • PUBLICAÇÕES >
      • RESULTADOS CIENTIFICOS
      • RELATÓRIOS PROPOLAR
    • RELATÓRIOS INTERNACIONAIS
    • NORMATIVAS POLARES
    • MULTIMÉDIA
    • EXPOSIÇÕES >
      • EXPOSIÇÃO CARTOGRÁFICA
      • EXPOSIÇÃO FOTOGRÁFICA
      • FICHAS EDUCATIVAS

NITROEXTREM: Bem, quase que já estou de partida! 

17/11/2014

 
O tempo aqui demonstrou ser um grande sprinter, não pára e, quando dou por mim, já quase passaram 3 meses. Mas bem, as experiências ficam comigo e as memórias guardo-as para talvez um dia serem escritas. Nas semanas que passaram tenho prosseguido com as minha incubações. Tenho continuado a extrair DNA e RNA e comecei a tentar amplificar o gene que estou a estudar, o gene amoA responsável pela transcrição da enzima ammonia monooxigenase. Esta enzima promove a oxidação da amónia num composto intermediário - a hidroxilamina. Esta reação promove a libertação de eletrões que são transferidos ao longo de uma cadeia, na qual será libertada energia fundamental para o funcionamento celular. Esta reação é bastante importante para a nitrificação uma vez que é o passo limitante deste processo. Este gene é também usado como um marcador funcional das bactérias e arqueias que oxidam a amónia. Então, a boa notícia, é que nas amostras de solo do Miers consegui detectar o gene no DNA em todas as amostras até agora processadas, tanto no domínio Bacteria como no Archaea, mas ainda mais entusiasmante, foi que consegui detectar o gene no cDNA (derivado do RNA) de algumas amostras extraídas, dando a indicação que ele esta a ser expresso. Deste modo, estes resultados deram-me a indicação de que as comunidades nitrificantes não só estão lá presentes (demonstrado pelo DNA), como também estão ativas (demonstrado pela presença do gene no RNA). No que toca ao solo do Beacon os resultados não são tão positivos, uma vez que ainda não consegui detectar o gene em nenhuma amostra; no entanto, continuo a trabalhar nisso.

Um método que estou também aqui a aprender é a nova tecnologia de sequenciamento da Life Tecnhlogies chamada Ion Torrents. Esta tecnologia é capaz de gerar milhares de sequências num relativo curto espaço de tempo (8h no máximo). Este método baseia-se na detecção de protões que são libertados durante a polimerização do DNA. Os protões libertados vão conduzir a alterações no pH num chip, que serão lidas pela máquina. A preparação das amostras envolve um grande cuidado e precisão. Assim, muito brevemente, o que se faz é o seguinte: extrai-se o DNA; amplifica-se o DNA para o gene que queremos sequenciar (no meu caso sequenciei o 16S); nesta amplificação usamos um primer que contém um código que identificará a nossa amostra durante a sequenciação. Assim cada amostra tem um código diferente, o que possibilita juntar diferentes amostras na mesma corrida de sequenciação. Após a amplificação cada amostra é quantificada e limpa. Esta é novamente quantificada (durante o processo de limpeza há sempre perda de DNA) e diluída para uma determinada concentração. 
Imagem
Emulsion PCR
Imagem
Enrichment
Imagem
Sequencing Chip
Imagem
Ion Torrents Sequencer
Imagem
Para ver o estado da amostra corremos as amostras no 'bioanalzyser' e o que queremos ter é um limpo pico entre dois padrões. Feito isto começa-se a fazer a final 'genomic library'. Ou seja: primeiro diluímos cada amostra até uma determinada concentração e, de modo a obter-se equimolaridade, o mesmo volume de cada amostra é pipetado no mesmo tubo produzindo um pool de amostra. Este pool vai então ser sujeito a um 'emulsion PCR' ou seja, durante este processo cada fragmento/sequência de DNA vai ligar-se a uma bead presente num microreactor e vai ser amplificada cerca de 30000x. De modo a diferenciarmos as beads que contêm fragmento amplificado daquelas que não têm, faz-se um enrichment step. O produto enriquecido é então introduzido num chip com carácter semi condutor e sequenciado. Como disse inicialmente, cada vez que uma base é incorporada na cadeia de DNA há libertação de um protão alterando o pH de uma camada do chip, sendo essa alteração convertida numa alteração de voltagem lida pela máquina.

Deixo-vos algumas fotos desta técnica! 
Até breve!
Maria Monteiro

Comments are closed.

    ​BLOGS DAS CAMPANHAS
    PROPOLAR 2015-16,
    PROPOLAR 2014-15,
    PROPOLAR 2013-14.

    Os diários de campanha são escritos pelos investigadores durante as suas atividades de campo. As equipas dos projetos PROPOLAR integram investigadores de várias nacionalidades pelo que alguns destes posts serão publicados na sua língua original.​

    Este espaço inclui os registos das seguintes campanhas

    . PROPOLAR 2015-16:  
    de Novembro 2015 a Setembro 2016

    . PROPOLAR 2014-15:
    de Novembro 2014 a Setembro 2015

    . PROPOLAR 2013-14:
    de Novembro 2013 a Setembro 2014

    Welcome to the PROPOLAR journals. 

    The posts are written by researchers related to PROPOLAR projects, not only portugueses but from different nationalities. So you may find them written in different languages.

    Arquivo mensal de publicações

    November 2016
    August 2016
    July 2016
    June 2016
    May 2016
    April 2016
    March 2016
    February 2016
    January 2016
    December 2015
    November 2015
    October 2015
    September 2015
    August 2015
    July 2015
    May 2015
    April 2015
    March 2015
    February 2015
    January 2015
    December 2014
    November 2014
    October 2014
    September 2014
    July 2014
    April 2014
    March 2014
    February 2014
    January 2014
    December 2013
    November 2013


    RSS Feed


    Arquivos anteriores em...
    • PROPOLAR 12-13 
    • PROPOLAR 11-12 

Powered by Create your own unique website with customizable templates.